法医测序实用集合篇｜如何分析测序数据中识别的变异位点→

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Apr 24, 2025
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之前我们讲到了如何利用分析工具进行纳米孔测序数据的变异检测，但是对于检测出的变异位点，我们要如何理解和分析，进一步确定可信且有用的位点呢？本文将进行简单的介绍，也会捎带上关于疾病有关的变异位点的解析，希望你可以从中有所收获。
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一、生信分析验证

1. 数据质量评估

  • 测序深度（Depth）：
    • 目标区域覆盖深度需≥20x（临床诊断建议≥50x），深度过低可能导致假阳性。
    • 使用工具：samtools depth、IGV查看局部深度。
  • 碱基质量（Base Quality）：
    • Qphred值≥30（错误率≤0.1%，主要针对于二代平台），排除低质量位点。
    • 使用工具：FastQC、MultiQC。
  • 比对质量（Mapping Quality）：
    • 比对质量（MAPQ）≥20，排除比对模糊的reads（根据研究需求可以更高）。
    • 使用工具：samtools view -q 20。

2. 交叉验证工具

  • 不同变异检测工具对比：
    • 同时使用 GATK HaplotypeCaller、FreeBayes、Samtools mpileup 等工具，若多个工具均检测到同一变异，可靠性更高。

3. 数据库过滤

  • 已知变异数据库：
    • dbSNP、gnomAD、千人基因组计划：观察是否为常见多态性位点。
    • ClinVar、HGMD：检查是否已被报道为致病变异或良性变异。
    • 使用工具：Annovar、VEP、SnpEff注释。

4. 功能预测

  • 有害性预测：
    • 错义变异：SIFT（预测有害）、PolyPhen-2（可能破坏蛋白结构）。
    • 剪接变异：MaxEntScan、SpliceAI（预测剪接位点影响）。
    • 使用工具：CADD（综合评分>20提示可能有害）。

5. 覆盖不均与链偏好性检查

  • 链偏好性（Strand Bias）：
    • 变异reads在正负链的比例需接近（如Fisher精确检验p>0.05）。
    • 使用工具：IGV可视化reads方向分布。

二、实验验证

1. Sanger测序

  • 适用场景：验证少量候选变异（或<20个位点）。
  • 步骤：
      1. 设计引物（Primer3、Primer-BLAST），确保扩增区域覆盖变异位点。
      1. PCR扩增目标区域并测序。
      1. 比对测序峰图，确认变异是否存在。
  • 优点：金标准，准确率高（>99%）。
  • 缺点：通量低，成本较高。

2. 数字PCR（dPCR）或定量PCR（qPCR）

  • 适用场景：验证低频变异（如体细胞突变或嵌合体）。
  • 优点：可检测低至0.1%的等位基因频率。
  • 示例：
    • 使用TaqMan探针区分野生型和突变型等位基因。

3. 长读长测序（PacBio或ONT）

  • 适用场景：验证复杂结构变异或重复序列区域的变异。
  • 优点：可跨越短读长无法覆盖的区域（如Alu元件、串联重复）。

4. 家系分析

  • 分离验证（Segregation Analysis）：
    • 检查变异是否与表型共分离（如显性遗传病中患者携带，健康亲属不携带）。
    • 示例：父母-子女三人组测序验证新发变异（de novo）。

三、可靠性验证的关键指标

指标
可靠标准
测序深度
目标位点深度≥20x（临床建议≥50x）
变异频率
杂合变异：等位基因频率（VAF）≈50%（±10%）；纯合变异：VAF≥90%
工具一致性
≥2种变异检测工具支持
实验验证
Sanger测序或dPCR确认
数据库支持
排除gnomAD等数据库中高频率（>1%）的良性多态性

四、常见问题与解决方案

  1. 假阳性变异：
      • 原因：测序错误、比对错误（如重复区域）。
      • 解决：提高测序深度、使用更严格的过滤参数（如GATK的VQSR）。
  1. 假阴性变异：
      • 原因：低覆盖度或高GC含量区域。
      • 解决：靶向捕获或长读长测序补洞。
  1. 嵌合变异：
      • 验证方法：数字PCR或单分子测序（如HiFi reads）。

五、验证流程示例

  1. 初筛：
      • 生信分析筛选出候选变异（如致病性预测为“可能致病”的变异）。
  1. 优先级排序：
      • 根据ACMG标准、表型关联（如HPO术语匹配）排序。
  1. 实验验证：
      • 对Top 10候选变异进行Sanger测序。
  1. 临床解读：
      • 结合实验验证结果、家系数据和文献报道，最终分类为“致病”或“良性”。

六、工具与资源推荐

  • 生信工具：
    • 变异注释：Annovar、VEP、Ensembl VEP。
    • 可视化：IGV、Integrative Genomics Viewer。
  • 实验设计：
    • 引物设计：Primer-BLAST、Primer3。
    • Sanger分析：SnapGene、Chromas。

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