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Jan 9, 2025

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非人类法医学研究现状

近年来，非人类 DNA 在法医领域的重要性以及应用类型大大增加。动物和植物材料的分子物种鉴定对于野生动物贩运和犯罪现场调查都至关重要。动物法医遗传学的重点是非人类物种，大致可分为两类：家养物种和野生动物。如果是进行家养物种的相关法医学调查，那么就并非简单的物种类别的鉴定了，而是需要对实际的宠物进行个体鉴定。特定动物的鉴定采用与人类鉴定类似的方法，即使用微卫星标记。法医植物学主要难点在于植物遇到的常见部分通常以改变性状形式而出现，例如木材采伐、树叶或根碎片、粉末、草药制剂和药用衍生物、缉获的药物或受保护的外来物种，这些物种表现形式通常不允许在视觉层面上识别所属物种的类别。

1.宠物：狗和猫是两种常与人类密切接触的宠物物种。狗或猫的毛发与法医证据（如衣服、汽车座椅和家用软装饰品）有关，这也为案件的侦破提供了另一条可行的思路（可参见案例1）。那么构建对应的宠物的STR的数据库在非人类法医研究中具有重要意义。

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2.野生动植物：野生动物法医学中提出的一个问题是“这是哪个物种？“，这是因为许多国家/地区的立法禁止源自受法律保护物种的贸易，受保护物种的非法贸易是许多野生动物法医学的核心。在部分物种的性状发生改变时，例如象牙、犀牛角和穿山甲鳞片是 DNA 处于痕量水平的证据检测案例，这也是非法野生动物贸易中遇到的许多缉获的典型特征，此时 mtDNA 是唯一可用的遗传物质。同时物种鉴定通常也是区分人类或非人类来源的痕迹的问题，当发现人类和动物骨骼遗骸混合时，以便找到人类检才并最终进行个体化鉴定。

非人类法医研究的重点

样本获取

当法医调查开始时，第一步是正确识别非人类法医证据检材，这是一个关键点，由于缺乏识别的正确习惯，这一阶段的处理差异会导致此类证据的丢失。通过仔细收集照片和描述性文件来记录犯罪现场是其中的关键点，因此，所有在犯罪现场工作的法医专家都必须接受充分培训以了解他们需要寻找和发现的目标内容。最后改进非人类 DNA 分析标准化，尤其是法医植物学，有助于加强 DNA 分析在调查环境中的价值和有用性。

分子特征

当前法医物种鉴定的金标准方法是通过保守引物扩增对可变区进行分析，流程包含 DNA 提取和定量、PCR 扩增以及 Sanger 测序，然后与参考数据库中可用物种序列进行序列比对。对于动物样品，使用的方法和试剂盒通常是已经针对人类 DNA 应用和验证的方法以及试剂盒，因此大多数方案须根据要处理的生物材料的类型进行调整。对于植物DNA的鉴定目前缺乏植物 DNA 标准化分离方案，主要原因在于植物的高度生物多样性以及不同组织和植物成分的提取效率的差异。

线粒体（mtDNA）在每个细胞中的拷贝数量很多且不易发生重组，是动物法医分类学鉴定的主要选择。最常用的动物物种鉴定标志物是 cytb、COI、16S rRNA、12S rRNA。事实上，对动物进行条形码编码的标记物对植物来说并不实用，因为植物基因组的进化方式并不相同。目前 Ribulose 1,5-biphosphate carboxylase (rbcL)（rbcL）和 maturase K （matK）是常用于解析陆地植物的条形码区域，且常采用多位点方法进行鉴定；同时鉴于植物种类的复杂性，通常还需要来自叶绿体和核基因组的补充区域，以确保所鉴定的植物群体的样本可被准确识别。

数据库及数据处理

基于 DNA 的动植物材料准确分类也严重取决于目标分类群的可用参考序列的质量。理想情况下，任一数据库中包含的所有参考序列都应该来自最初由分类学专家鉴定的凭证标本，但实时并非如此。常用的数据库为GenBank和BOLD，GenBank数据库中包含数以亿计的 DNA 序列并且可公开访问，为物种鉴定的序列比对提供了丰富的参考，但是上传到 GenBank 的序列通常不受监管，可能导致参考物种序列不确定性。由 CBOL 构建的BOLD 数据库收集了全球范围内多种类型生物的基因序列、图像、分布地理信息等，可广泛应用于物种鉴定、种群遗传学、物种分类和进化研究。

因为法医需要遵守的质量标准特别严格，那么长期进行基于 DNA 的物种鉴定的实验室（尤其是用于野生动物分析的实验室）通常会开发一个内部参考数据库，该数据库包括当地动植物的物种序列，方便在进行物种鉴定的时候有更复合当地特色且信息准确的数据库作为鉴定依据。从技术上讲，一个重要任务是鼓励使用科学界批准的通用和标准化 DNA 区域以及引物进行物种鉴定。同时另一个需要解决的点是公共数据库的物种覆盖率，扩展主要的公共序列数据库（包括更多法医专家可能感兴趣的参考物种）是科学界的当务之急。对于大多数野生动物生物种群，目前公共数据库中的遗传数据极度贫乏，仅涉及特定的基因组片段，丰富且完整的数据库至关重要（特别是对于植物的识别），因为 BLAST 搜索算法在创建相似性分数的排名时更喜欢序列长度，从而导致将样本未能识别到正确的物种上。

纳米孔测序在非人类法医学中的应用

法医遗传学领域需要可靠、可重现且高度准确的 DNA 测序方法，传统的 Sanger 测序仍然是法医遗传学的金标准方法。然而，Sanger 测序有局限性;它只能为每个扩增的 PCR 产物（扩增子）生成一个读数，并且无法分析由两个或多个供体组成的混合或污染的 DNA 样品。为了克服这些限制，法医界开始转向 HTS 技术，这些技术能够同时从数百个样本中产生数百万个读数，从而可以有效地区分混合物中来自多个生物来源的污染或贡献。例如，Illumina 著名的 MiSeq 平台已验证可用于人类 STR 分析，以及用于非人类法医目的的混合样本中濒危物种的鉴定，但 MiSeq 等平台价格昂贵。此外，为了生成扩增子重测序所需的数据极少量，只有当同时对大量样品进行测序时，数据生成才具有成本效益。这使得MiSeq不切实际，并且超出了许多低通量最终用户（如非人类法医科学家）的能力范围。新兴的 HTS 技术（如 ONT 的 MinION）有可能通过在经济实惠的平台上提供具有成本效益的数据用于法医目的来解决这一限制。

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Nanopore sequencing in non-human forensic genetics

纳米孔测序具有实时、长读长、便携等优点，虽然准确率与一二代测序相比略逊色，但目前许多应用都证明了其能生成高度可靠的一致性序列，主要应用为基因组或染色体组装、DNA barcoding、HLA 分型和 meta-barcoding。同时在野生动物DNA鉴定中也可能成为一个不错的选择，例如ONT MinION 的尺寸和便携性确实允许通过背包实验室系统在现场进行纳米孔测序。除了案件工作之外，构建更丰富，更完整更因地制宜的野生动物 DNA 参考数据库（例如动物全长线粒体数据库），对于野外工作的法医也至关重要，纳米孔测序的长读长测序或许能为此提供更好的解决方案。关于新兴的HTS技术，目前也有对应的基于纳米孔测序的分析流程的发布，例如NGSpeciesID，这也为利用纳米孔测序进行非人类法医的物种鉴定带来可能。

最后，人类法医遗传研究与非人类法医遗传研究都是法医遗传学的重要组成部分，一代测序，二代测序以及三代测序都为其提供了互补的工具。实际应用中可以针对不同的研究方向选用不同的测序平台，或利用不同平台组合分析，这些都是解决法医学问题的新范式。

参考

Linacre, A. Animal Forensic Genetics. Genes 2021, 12, 515.

Niamh Nic Daeid, Lucina Hackman, Rob Ogden, Nina Vasiljevic, Stefan Prost; Nanopore sequencing in non-human forensic genetics. Emerg Top Life Sci 24 September 2021; 5 (3): 465–473.

Hall CL, Zascavage RR, Sedlazeck FJ, Planz JV. Potential applications of nanopore sequencing for forensic analysis. Forensic Sci Rev. 2020;32(1):23-54.